配子發(fā)生機制研究不僅是魚類生殖生物學(xué)研究的重要命題，而且是突破魚類借腹生殖等精準(zhǔn)育種技術(shù)的科學(xué)需求。在魚類雄性性腺中，精子發(fā)生過程包含有生殖細(xì)胞的有絲分裂和減數(shù)分裂，產(chǎn)生從精原細(xì)胞到精母細(xì)胞再到精子細(xì)胞的眾多生精細(xì)胞（spermatogenic cells）亞型。對這些不同亞型的生精細(xì)胞進(jìn)行精確鑒定，是魚類精子發(fā)生研究的基礎(chǔ)。目前對魚類生精細(xì)胞亞型的鑒定通?；诩?xì)胞及細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)特征，其準(zhǔn)確性和可靠性強烈依賴于研究者的經(jīng)驗，很大程度上缺乏細(xì)胞生物學(xué)證據(jù)。理論上，利用生精細(xì)胞發(fā)育和分化過程中特征性蛋白的表達(dá)譜式，將能夠更加客觀和準(zhǔn)確地鑒定不同亞型的生精細(xì)胞。然而，目前可用于魚類生精細(xì)胞鑒定的工具抗體十分缺乏，加之現(xiàn)有的免疫熒光技術(shù)無法適應(yīng)大數(shù)據(jù)驅(qū)動的高通量研究新范式，嚴(yán)重阻礙了這一研究領(lǐng)域的發(fā)展。 

　　中國科院水生生物研究所孫永華團(tuán)隊針對上述難題，系統(tǒng)開發(fā)了特異性識別魚類配子發(fā)生相關(guān)的Ddx4（Vasa）和Piwil1蛋白，以及減數(shù)分裂和有絲分裂相關(guān)的Sycp3和Pcna蛋白的一套多克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了一個適應(yīng)于高通量操作的免疫熒光技術(shù)流程（圖1）。利用這些抗體和建立的高通量免疫熒光技術(shù)，該團(tuán)隊精細(xì)鑒定了斑馬魚、稀有鮈鯽、鯉魚、團(tuán)頭魴、草魚、黃鱔等多種魚類的生精細(xì)胞亞型。 

圖1 抗體制備和優(yōu)化的免疫熒光技術(shù)流程，及抗體的蛋白質(zhì)免疫印跡檢測  

　　該團(tuán)隊以斑馬魚精巢為研究對象，通過Ddx4、Pcna、Sycp3及細(xì)胞核的四色免疫熒光共染實驗，實現(xiàn)一次性精細(xì)鑒定了13種不同亞型的生精細(xì)胞。它們分別是靜息態(tài)單細(xì)胞A型精原細(xì)胞quiescent SPG-A(1-cell)、有絲分裂態(tài)單細(xì)胞A型精原細(xì)胞mitotic SPG-A(1-cell)、精小囊中含有2、4或8個細(xì)胞的A型精原細(xì)胞SPG-A(2,4,8-cell)、精小囊中含有16或32個細(xì)胞的B型精原細(xì)胞SPG-B(16,32-cell)、精小囊中含有64、128或256個細(xì)胞的B型精原細(xì)胞SPG-B(64,128,256-cell)、細(xì)線期初級精母細(xì)胞SPC-I(L)、偶線早期初級精母細(xì)胞SPC-I(EZ)，偶線中晚期初級精母細(xì)胞SPC-I(MZ/LZ)、粗線期初級精母細(xì)胞SPC-I(P)、次級精母細(xì)胞SPC-II、精子細(xì)胞SPD和精子SPZ（圖2A-J）。最后，他們提出了基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)和特征蛋白表達(dá)譜式來鑒定魚類生精細(xì)胞13個亞型的新標(biāo)準(zhǔn)（圖2K）。 

　　值得一提的是，在斑馬魚精子發(fā)生領(lǐng)域，前人學(xué)者僅根據(jù)形態(tài)特征，就武斷地將SPG-A(1-cell)稱作未分化的A型精原細(xì)胞（SPG-Aund），而將SGP-A(2,4,8-cell)統(tǒng)稱為分化的A型精原細(xì)胞（SPG-Adiff），導(dǎo)致這一概念在領(lǐng)域內(nèi)被廣為傳播。孫永華團(tuán)隊通過上述生精細(xì)胞亞型鑒定的新標(biāo)準(zhǔn)，更正了這一領(lǐng)域長久以來的錯誤定義，提出了更為客觀的命名標(biāo)準(zhǔn)，為深入開展魚類精原干細(xì)胞自我更新和分化研究提供了更加科學(xué)的定義和更為強大的工具。 

圖2 利用Ddx4、Pcna、Sycp3及細(xì)胞核的四色免疫熒光技術(shù)對不同亞型生精細(xì)胞進(jìn)行精確鑒定（A-J）），提出魚類生精細(xì)胞亞型鑒定的新標(biāo)準(zhǔn)  

　　近日，相關(guān)研究成果在線發(fā)表于國際學(xué)術(shù)期刊Frontiers in Endocrinology（https://doi.org/10.3389/fendo.2023.1044318）。水生所孫永華研究員為通訊作者，青年研究員葉鼎和碩士研究生劉濤為共同第一作者，水生所朱作言院士、胡煒研究員、汪亞平研究員等參與合作研究。該項研究獲得國家自然科學(xué)基金等資助，文中產(chǎn)生的各類抗體資源已保藏至國家水生生物種質(zhì)資源庫國家斑馬魚資源中心。